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細節決定western blot的結果

 發布時間:2022-04-26 點擊量:221

細節決定western blot的結果

細節決定成敗,western blot更是如此,那讓我一一為大家介紹這些細節的地方吧。 

一、 樣品準備部分

有好的開始,才會有好的結果。良好的樣品的制備,是WB的重中之重,特別是以下幾個方面:

1. 時間把控到位

盡管樣品的處理濃度可能不同,處理時間也可能不同,無論是孵育的時間還是終止的時間,都要按照預先設計的時間來進行,提前或者推遲,都會影響最終的結果。

2. 防止蛋白降解

防止蛋白降解的方法通常有兩種:

(1)低溫操作

所有的用具、樣品、裂解液等都提前預冷,實驗全程在低溫(4℃)下操作,可以有效防止蛋白講解

(2)蛋白酶抑制劑

將蛋白酶抑制劑和PMSF共同使用,能有效防止蛋白降解。

3. 裂解液用量把控精確

裂解液的用量直接決定了細胞裂解程度以及裂解后的蛋白濃度。若裂解液量較少,就會導致蛋白濃度太高,與上樣緩沖液反應不充分,電泳后會出現多條條帶,條帶形狀也不好;裂解液過多,蛋白濃度被稀釋,會導致在膠孔中的上樣量不足,條帶不清晰。

二、 WB 電泳部分

有了好的開端,再加上好的過程,勢必會有好的結果。WB過程中需要注意的細節如下:

1. 制膠

Biorad的制膠試劑盒,讓制膠的日子灑滿了陽光。

2. 上樣

實驗不同,上樣的總蛋白量稍有不同。若上樣體積小的,可用槍頭直接上樣;若上樣體積>20ul,建議采用微量注射器;若上樣體積太大,可采取間斷上樣。

3. 電泳

樣品到達分離膠之前,控制電壓≤60V,能有效解決樣品排列不整齊的問題。樣品到達分離膠之后,可調節電壓為100V,若時間充足,維持電壓在60V以下,效果更好。

4. 轉膜

電泳開始后就配置電轉液,加入甲醇,預冷。預冷是神助。

我們的實驗,有了上述的神助攻的細節,期待你的結果吧。


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